专家点评Nature | 李天晴/季维智团队绘制原肠前人胚胎的发育全景图谱

点评 | 张建（云南大学）

责编 | 兮

人的生命起源于早期胚胎，人类受精卵的发育始于一系列卵裂和形态发生重排，形成囊胚。晚期囊胚包含三个不同的细胞谱系：胚胎组织（上胚层细胞）和两个胚外组织（下（内）胚层细胞和滋养外胚层），在植入子宫后，前者产生三胚层细胞以及整个胎儿，而后两者分别产生卵黄囊和胎盘。对囊胚前人胚胎的发育，已经开展广泛的研究，取得了重要的进展。然而，在发育的第7天，人胚胎需植入母亲的子宫中才能继续存活和发育。这个阶段胚胎在子宫体内发生的变化以及导致这些变化的关键细胞和分子事件，由于材料的无法获得以及缺乏相应的体外研究体系导致这些问题仍处在黑匣子状态。胚胎无法植入以及在此阶段的发育异常是导致早期妊娠流产的主要原因。着床后人胚胎发育是生命发生的重要科学问题之一，对其关键事件的理解对人类干细胞、组织器官再生研究和应用以及对不孕症、早期发育疾病的预防与治疗极为关键。

2016来自剑桥大学以及洛克菲勒大学的Zernicka-Goetz和Brivanlou两个团队取得了里程碑的突破（Science杂志将其评为2016年全球10大科技进展之首），他们在二维（2D）培养皿中成功将人囊胚（E5-E6）延迟培养到12-13天【1,2】，这些2D培养的胚胎初步显示出体内胚胎发育的一些简单结构。在此体系基础上，汤富酬和乔杰课题组最近利用单细胞转录组和DNA甲基化图谱，解析了人类胚胎在此过程中的一些发育机制，扩展了对这个阶段的人胚胎发育的认识【3】（详见BioArt报道：Nature | 汤富酬/乔杰合作利用单细胞转录组和DNA甲基化组图谱重构人类胚胎着床过程——附专家点评）。然而在培养皿中进行2D培养的胚胎存在一些重要缺陷，比如二维培养的胚胎是扁平的，与体内3D胚胎有明显的差异；2D培养的胚胎其细胞之间的拓扑关系和连接与体内胚胎存在明显的差异；虽然2D培养胚胎的滋养外胚层12天后仍在继续存活，但整个胚胎结构发生了坍塌和出现了发育的紊乱，导致很多细胞类型（羊膜上皮）、腔（羊膜腔、卵黄囊）和结构（基底膜、前后轴、原条）无法在2D培养的胚胎中清楚地观测到【4-6】。因此，这些缺陷限制了该体系很难真正模拟体内胚胎的发育。

2019年12月13日凌晨，昆明理工大学灵长类转化研究院的李天晴教授和季维智院士领衔的研究团队在Nature杂志上以长文形式发表论文“A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos”，首次建立人胚胎三维培养系统，绘制了人原肠前胚胎的发育全景图，为研究人着床后的早期胚胎发育建立了重要的研究基础。

该研究中，作者在获得严格的伦理允许和病人知情同意的条件下，利用临床上捐献的胚胎，首先通过改善培养基和培养方法，开发了一个三维（3D）人囊胚培养体系，克服二维（2D）无法模拟胚胎发育的缺陷。采用该体系首次将人囊胚在3D条件下培养到原条阶段（第14天），但未出现早期神经系统的发育，符合胚胎研究的国际伦理。这些3D胚胎能高度地模拟了体内胚胎的发育，经历不同形态的发育并自发组装成2D条件下无法产生的3D结构，包括胚胎双层杯盘、羊膜（amnion）、基底膜（basal membrane）、初级和灵长类独特的次级卵黄囊、前后轴和原条。

利用上述体系，作者研究并揭示了人原肠前胚胎的关键发育事件：1）通过大量单细胞的转录表达谱的分析，揭示了上胚层细胞、下胚层细胞和滋养层细胞谱系分化和发育的动态和分子调控网络；2）羊膜上皮细胞（AME）是上胚层细胞分离出来的第一类细胞系，不同于啮齿类动物，人AME发生于原条形成之前，但其特性和分子机制不清楚。作者研究发现：与上胚层细胞相比，AME显著地下调多能性基因，其形成与基底膜的缺失显著相关，并有独特的分子表达谱；3）作者首次阐明细胞滋养层（cytotrophoblast）、绒毛外细胞滋养层（extravillous cytotrophoblast）和合胞体滋养细胞（syncytiotrophoblast）在胚胎着床后的分化以及引起分化的信号和转录因子，揭示了绒毛外细胞滋养层在早期胚胎中不同于中、后期胎盘的功能；4）作者揭示了上胚层细胞（PSCs，多能干细胞）着床后将很快从naive到primed状态的转变。其PSCs表达谱的变化，主要发生在内细胞团到着床前上胚层细胞以及原条产生的两个阶段。相比较，PSCs在着床到第14天期间保持相对的稳定状态。而其发育和转化是由不同的多能因子协调作用所决定的；5）通过人和猴子胚胎的转录组分析，发现猴子和人上胚层细胞在代谢上具有明显差异，而在维持干细胞多能性以及发育的关键分子和信号通路上具有保守性。

人的胚胎在体外3D条件下发育到14天。

3D培养的人胚胎产生前后轴和原条的形成

3D培养的人原肠前胚胎的发育全景图。

总之，该研究首次系统研究了原肠前人胚胎和多能干细胞的发育过程，绘制了原肠前人胚胎的分子和形态发育全景图，填补了相关领域的空白。人胚胎三维培养系统的建立对探索人原肠前胚胎发育开辟了崭新的研究平台，为人类早期胚胎发育异常等重大疾病的临床药物研发和再生医学的发展提供了潜在的新工具，该技术未来结合人干细胞自组装为胚胎等技术，将进一步解析胚胎分化过程以及相关的信号通路调控，为人类深入认识胚胎发育机制提供了重要数据。

据悉，昆明理工大学灵长类转化研究院的李天晴教授和季维智院士为文章的共同通讯作者。昆明理工大学李天晴课题组博士生相立峰、博士后尹宇、郑云研究员及云南省第一人民医院马艳萍主任医师和李永刚主任技师为该文章的并列第一作者。昆明理工大学是论文的第一完成单位，云南省第一人民医院为第二单位。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-019-1875-y

专家点评

张建（教授，云南大学生命科学院副院长、生命科学研究中心副主任，国家“杰青”）

哺乳动物胚胎体内发育在三维时空上受到复杂而精细的调控，重要模式哺乳动物小鼠的胚胎发育包括细胞谱系建立已获得详实的研究结果【7】，近年来单细胞测序技术的结果进一步揭示了早期小鼠胚胎不同类型细胞的发育以及细胞之间的相互作用关系。与小鼠胚胎发育知识相比，灵长类胚胎早期发育进程仍然还有很多空白。灵长类早期胚胎发育的研究尤其是动态的发育进程的研究依然受制于培养条件，最近昆明理工大学季维智、谭韬、牛昱宇等领导的团队等多个研究机构以及中科院动物所及昆明动物所王红梅、李磊、郑萍领导的团队在Science杂志上分别发表了食蟹猴早期胚胎发育的文章，将食蟹猴胚胎体外培养延长到原肠形成（早期胚胎发育最重要的组织重构事件）后期/着床后发育阶段，揭示了多个与小鼠胚胎发育不同的现象，推动了对于灵长类胚胎发育的认识（专家点评丨中国学者Science背靠背揭示体外培养的灵长类动物早期胚胎发育图谱）【8，9】。与这些非人灵长类胚胎发育研究相比，人类胚胎动态发育的研究明显滞后，除了伦理上的限制之外（国际公认的人胚胎培养限制时间最多14天），人胚胎体外长期培养技术障碍是瓶颈之一。2016来自剑桥大学以及洛克菲勒大学的Zernicka-Goetz和Brivanlou实验室显著延长了人胚胎在体外培养的时间，这些培养的胚胎显示出体内胚胎的部分结构，扩展了对人早期胚胎发育的认识【10,11】。此外，Brivanlou团队利用干细胞体外自组装体系获得胚胎组织者并在鸡胚上获得了双体轴结果【12】等均是近年来人胚胎早期发育的重要进展。然而，以往人胚胎体外培养研究主要是在二维培养条件下进行的，不能够很好模拟体内胚胎三维发育的环境，导致体人胚胎发育不能持续较长时间或者发育明显异常（例如，不能观察到正常双层胚盘结构以及前后轴和原条形成）。

近日昆明理工大学李天晴、季维智领导的团队最近采用三维培养体系，成功将人囊胚开始的体外发育时间推至14天，实现了该领域的突破，相关结果在线发表在Nature杂志【13】。他们通过优化的IVF胚胎培养基结合10% matrigel等条件，实现了约1/4的囊胚发育到原条期，这些胚胎在形态以及分子标记上类似体内发育胚胎，因而实现了在体外连续研究囊胚到原条期多种发育事件、细胞分化迁移等过程。例如：与二维培养体系不同，该三维培养体系可以明确观察到上胚层（epiblast）与鳞状羊膜上皮细胞层（squamous amniotic epithelium）被羊膜腔分离开; 进一步分析发现体外培养人胚胎发育成明显的前后轴并形成原条（达到了国际允许的培养14天发育阶段），但是在14天培养胚胎中没有发现神经诱导发生。三维培养人胚胎显示上胚层细胞，滋养层细胞以及原始内胚层细胞持续增殖，提示体外胚胎在14天后可以继续发育。单细胞转录组数据显示了受精后6天到14天的胚胎着床前到着床后的基因表达连续变化，结合细胞谱系分化标志以及发育时间可将基因表达簇归为7个对应的分化细胞类群，进一步的基因表达分析发现三谱系细胞分化以及人滋养层和上胚层发育的转录调控，以及与食蟹猴胚胎发育的异同。

总之，人胚胎三维培养系统的建立使得人原肠形成前胚胎发育的研究成为可能，是该领域的技术上的突破。该技术结合人干细胞自组装以及异种嵌合胚胎等技术，将进一步解析胚胎分化过程以及相关的信号通路调控，可以预见人早期发育领域将迎来新的一页。

制版人： 小娴子

参考文献

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13.    Xiang L, Yin Y, Zheng Y,Ma Y, Li Y, Zhao Z , Guo J, Ai Z, Niu Y, Duan K, He J, Ren S, Wu D, Bai Y, Ji W, Li T (2019) A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulationembryos. Nature (in press)